westernblot（westernblot和SDSPAGE区别）

今天给各位分享westernblot的知识，其中也会对westernblot和SDSPAGE区别进行解释，如果能碰巧解决你现在面临的问题，别忘了关注本站，现在开始吧！

western blot实验步骤

western blot实验操作步骤如下：

1. 准备样品

1）制冰，准备冰盒。

2）配制细胞裂解液：根据细胞数量确定所需裂解液：50ul/六孔板一孔 。

裂解液配方：100ul碧云天裂解液+1ul蛋白酶抑制剂混合物+1ul PMSF

3）按实验需要准备好细胞：去掉培养基，1×PBS洗3次（去掉培养基中的血清），每个孔（6孔板）加入适量的裂解液。迅速用细胞刮刮下细胞并转移至1.5ml管中，置于冰上20min，振荡混合后，再置冰上10min。

2. SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳：制备分离胶（5ml/gel）

3. 膜转移

1) 切胶，按Marker指示和目的条带的位置切胶(注意将胶切角做记号)，将洗脱的胶浸入转膜缓冲液中15分钟。

2) PVDF膜做好记号后先浸入甲醇中1分钟，再连同4张3mm滤纸和海绵浸入转移缓冲液中15分钟。

western blot是干什么的

Western Blot中文一般称为蛋白质印迹。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

Western Blot显色的方法主要有以下几种：

i. 放射自显影

ii. 底物化学发光ECL

iii. 底物荧光ECF

iv. 底物DAB呈色

值得一提的是，western blot 这个名称的由来很有意思。最开始做印迹工作的是一个叫做Southern的科学家，但印迹的对象是DNA链，他把这种技术称为Southern blot，后来类似的出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对RNA，一个对蛋白质，人们分别把这两种技术的称为Northern和Western，与这两个技术的发明人没有关系了。

Western Blot原理技术

Western blot (蛋白印迹)

WB是一种把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持物(NC膜或PVDF膜)，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测。WB采用抗体作为探针，抗体可以与附着在固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生抗原-抗体免疫反应。这种技术的作用是对细胞或组织提取的蛋白混合物(即总蛋白混合物)中的某一特异蛋白进行鉴别和半定量分析，旨在鉴别特异性蛋白的类型(如亚型、聚体、剪切体等)和蛋白表达量的变化。

其基本流程如下：

前面·我们已经介绍过SDS-PAGE，电泳完成后如果要进行western blot则需要转膜

转膜：转膜有湿转和半干转两种不同方法。我用的是半干转移法，膜覆盖住胶，膜用balance buffer润湿（甲醇溶液）,盖子分别用top buffer和bottom buffer润湿后盖住，转膜10min。

注意：

1：膜大小合适，防止浪费.

2：盖好膜和凝胶后，凝胶、膜 推平，否则会导致转膜不完全。

3：注意一定要戴手套或塑料镊子接触膜，避免手上的蛋白和油脂降低转膜效率。

封闭：降低背景，占据膜上剩余的结合位点，使抗体只能与膜上的抗原特异性结合，一般用的是5%的脱脂奶粉，但值得注意的是对于磷酸化的抗体或生物素标记的抗体不能用脱脂奶粉，只能用5%的BSA。封闭时间室温1-2h。

一抗孵育：封闭结束后，用PBST稍微洗膜后倒掉，再加入PBST摇10min，反复洗三次后加入0.5%一抗+3%奶粉进行孵育2h，一般5mL，但上次我用10mL。一抗孵育时，要注意一抗的种属来源，我用的his标签，所以一抗是anti-his。一抗可以反复使用2-3次。

PBST 溶液  PBS 溶液中加入 0.1%吐温

洗膜：用PBST进行洗膜，10min/次，洗3-4次即可。

二抗孵育：洗膜结束后，后加入0.3%二抗+3%奶粉5mL孵育1h，再次洗膜。注意二抗的种属要与一抗的来源相对应，例如我的一抗是鼠抗，我的二抗是羊抗鼠。

检测：按 1：1 比例吸取显影液中的 A 液和 B 液于 1.5 mL EP 管中混合，一块胶100μL，后将混合液均匀滴加在 PVDF 膜上，用塑封袋将 PVDF 膜封好，放入显影仪中进行显影 (速度要快，尽量减少底物消耗)。

western blot原理是什么？

Western blot的原理：简单来说原理就是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

Western blot，中文为蛋白质免疫印迹试验，简单来说是抗原抗体特异性结合。

Western blot结果中背景较高的原因及建议：

膜封闭不够—延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。一抗稀释度不适宜—对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。一抗孵育的温度偏高—建议4℃结合过夜。膜在实验过程中干过—实验过程中要注意保持膜的湿润。检测时曝光时间过长—减少曝光时间。

western-blot实验步骤

Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。可按照以下步骤操作。

1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)

使用细胞裂解液，对贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品进行裂解。然后测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

2. 电泳(Electrophoresis)

(1) SDS-PAGE凝胶配制

SDS-PAGE凝胶（分离胶及浓缩胶）可以参考一些文献资料进行配制

(2) 样品处理

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，

  100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

(3) 上样与电泳

（1）冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。

（2）电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置 或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。

（3）为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在  100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适  当分离后即可停止电泳。

3. 转膜(Transfer)

（1）我们推荐在Western实验中选用PVDF膜。硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，  需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

（2）在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。 

转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。转膜的效果也可以用丽春 

红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。

4. 封闭(Blocking)

（1）转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。

（2）用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以在 4℃ 封闭过夜。

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)

（1）参考一抗的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。

（2）用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果 不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。

（3）回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

（1） 参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。

（2）用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

（3）回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤 3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

7. 蛋白检测(Detection of proteins)

（1） 参考相关说明书，可使用英格恩的Enlight等超敏ECL发光液来检测蛋白。

（2）洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。

8. 膜的重复利用(Membrane recovery)

如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜 

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