黄曲霉毒素测定（黄曲霉毒素测定的卫生学意义）

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经常看到人买黄曲霉毒素,这个是检验什么的啊?

黄曲霉毒素需要用elisa或者液相法检测。检验标的物中黄曲霉毒素的含量的。黄曲霉毒素分很多种，是高致癌物，很多食品都需要做这个检测，饲料甚至也要做。

黄曲霉毒素是由黄曲霉菌分泌出的，黄曲霉菌普遍存在于空气中，所以只要有空气的地方就可能有黄曲霉毒素。至今已分离出的黄曲霉毒素及其衍生物有20多种，在天然食物中以黄曲霉毒素B1最为多见，危害性也最强，而此次牛奶检测超标的黄曲霉素M1则是黄曲霉毒素B1的代谢产物。

扩展资料：

从化学结构上看，黄曲霉毒素是高度取代的香豆素。其中AFB1类为甲氧基、二呋喃环、香豆素、环戊烯酮的结合物。AFG1类结构为甲氧基、二呋喃环、香豆素和环内酯。自然环境下，在被污染的食品中只检测出AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2，其中以AFB1存在量最大也毒性最高，AFM1是AFB1的代谢产物，毒性仅次于AFB1。

黄曲霉毒素的各种代谢产物的毒性强弱顺序是：AFB1AFM1AFG1AFB2AFM2AFG2。从毒性顺序可以看出，结构中双呋喃环末端具有双键结构的毒性大，不具双键结构的毒性相对较小。

参考资料来源：百度百科-黄曲霉毒素

中药材黄曲霉素是用以下哪种方法检验的

2015版《中国药典》中国家食品药品监督管理局对陈皮、僵蚕、桃仁、胖大海、酸枣仁、薏苡仁、柏子仁、莲子、麦芽、使君子、槟榔、肉豆蔻、决明子、远志、大枣、地龙、水蛭、全蝎、蜈蚣等19种药材及其饮片品种项下增加“黄曲霉毒素”检查项目。药典限量为黄曲霉毒素B1不得过5 μg/kg，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量不得过10 μg/kg 。同时第四部2351规定黄曲霉毒素测定采用高效液相色谱法，另外药典增补描述该法增加柱后光化学衍生法检测。Pribolab KRC光化学柱后衍生器，双波长254nm/352nm衍生光源，FEP衍生反应池线圈10米，光源寿命超3000小时，不需要任何衍生试剂。配合PriboFast黄曲霉毒素免疫亲和柱。

用什么样的仪器检测饲料中的黄曲霉毒素

如果是样品初筛，可以使用黄典霉菌毒素快速检测仪、检测卡，这在网上可以找到。如果需要精确检测，则：

黄曲霉毒素的检测方法

黄曲霉毒素的分析方法从最初以薄层层析法为主，发展到高效液相色谱法、微柱法、酶联免疫吸附法等多种普遍应用，其进展与新的化学检测手段和新仪器的出现密不可分。这些新方法、新手段的快速应用，为黄曲霉毒素的检测分析提供了更广泛的选择余地，适应了不同的检测目的和要求。

2.1薄层色谱法(TLC)

TLC法是测定黄曲霉毒素的经典方法,是我国测定食品及饲料中AFTB1的标准方法之一(GB/T5009.23—1996)[9]。其原理是样品经过提取、柱层析、洗脱、浓缩、薄层板展开分离后,在365nm紫外灯下,AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分别显示紫色、蓝紫色、绿色和绿色荧光。并根据其在薄层上显示的最低检出量来确定其含量。TLC有单向展开法和双向展开法,其中双向展开法能进一步除去样品中的杂质,提高灵敏度。TLC法由于设备简单,易于普及,所以国内外仍在使用,但由于该法样品前处理繁琐,且提取和净化效果

不够理想,提取液中杂质较多,因而在展开时影响斑点的荧光强度,双向展开法虽避免了杂质干扰,但增加了操作步骤和时间。TLC法较适合于对黄曲霉毒素的定性检测,是研究黄曲霉毒素初期所使用的主要方法。

该检测方法所用设备简单、费用低廉、容易掌握,适用大量样品的分离、筛选,一般的实验室均可开展,属于定性和半定量检测。

TLC有单向展开和双向展开法,其中双向展开法能进一步除去样品中的杂质,提高灵敏度,省略了柱层析等净操作步骤。TLC法由于设备简单,一般实验室都能满足,利于普及,仍是现在检测AFT的主要方法之一。Stroka[10]开发出的光度检测器在检测AFT时,最低限可以检测到1ng。Otta等在TLC上结合光度计,不仅能把样品提纯,而且也能同时1次对多个样品进行检测[11]。江湖等利用HPTLC检测农产品中的AFT,AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的检出限达0.8、0.4、0.7、0.4μg/kg[12]。王宏亮对国际(3B/T5009·22-1996)所规定的方法进行了部分改进，在利用CCl4抽提前，加人质量分数25%的醋酸铅溶液和质量分数4%的NaCl溶液，再用CCl4振动抽提，于薄层板点样后展开时，先用CCl4丙酮的混合液正向展开，然后用无水乙醚进行反向展开，回收率为76.9%，最低检出限量为5×l0-9，改进后的方法进一步排除了蛋白质杂质，使提取与净化效果增强，在薄层双向展开时组分分离也更安全，AFTB1形成的斑点易观察，操作简便，但增加了操作步骤[13]。

2.2高效液相色谱法(HPLC)

HPLC是近几年发展起来的检测AFTB1方法,主要是用荧光检测器检测,在适宜的流动相条件下,采用反相C18柱,使多种黄曲霉毒素同时分离。高效液相色谱法灵敏、分辨率高,可作定性、定量分析,同时可检测多个黄曲霉毒素种类,适于大批量样品的分析。

宋欢采用佛罗里硅土净化柱净化，三氟乙酸柱前衍生检测饲料中AFTB1，回收率为83%，相关系数r=0.9998[14]。李佐卿等则将免疫学技术和HPLC法相结合,采用免疫亲和柱对样品进行净化,AFTB1回收率达到97.3%,相关系数r=0.9994,最低检出限为6.25 pg,该法将提取、净化、浓缩一次完成,大大简化了前处理过程,提高了工作效率及方法的灵敏度,但增加了成本[15]。文镜采用国产硅镁吸附柱层析分离纯化玉米中AFTB1,用HPLC法检测,方法简便,纯化效果好,最低检出量为0.08 ng,回收率为92.87%,该法制柱方便,而且降低了成本[16]。

高效液相色谱法仪器设备昂贵,技术水平要求高,每次实验所使用的化学药剂和处理途径对试验结果影响程度差别很大,对实验结果的精度造成影响；样品还需进行繁琐的纯化处理,不适合快速检测。

2.3微柱法

微柱筛选法是将样品提取液通过由氧化铝与硅镁吸附剂组成的微柱层析管,杂质被氧化铝吸附,黄曲霉毒素被硅镁吸附剂吸附,在365 nm紫外线下呈蓝紫色荧光,其荧光强度在一定范围内与黄曲霉毒素的含量成正比,由于微柱不能分离黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2,故检测结果为黄曲霉毒素的总量。

微柱筛选法测定黄曲霉毒素,主要是用来检验黄曲霉毒素的存在与否以及快速筛选出超标样品。要对黄曲霉毒素种类进行区分定量检验,则需要对不同黄曲霉毒素组分进行分离,再利用其它方法检测。因此,微柱筛选法并不能完成整个黄曲霉毒素的检测过程,仅适用于定性检验。

陈达民通过微柱法测定黄曲霉毒素,样品经前处理后，即在365nm紫外光下观察结果，有微黄色荧光出现，则样品不含黄曲霉毒素，若蓝紫色荧光出现，则为阳性检出，再根据其荧光强度与事先已知含量的黄曲霉毒素标准管相比较确定其含量[17]。

2.4免疫化学法

免疫化学法是根据免疫学抗原抗体高特异性结合,设计并发展起来的免疫学检测技术[18]。具有重现性好、灵敏度高、选择性强、特异性强、时间短、检测限低等特点,同时又能减少有害试剂的使用,对检测人员健康起一定保护作用,在AFT检测方面取得了很大的应用。具有代表性的主要有免疫层析法(IICA)、放射免疫分析方法(RIA)和酶联免疫法(ELISA)等,它们均可以进行定量测定。

2.4.1免疫亲和柱荧光光度法(IAC)

IAC是美国公职化学家协会(AOAC)检测AFT的标准方法。其原理是利用单克隆免疫亲和柱为分离手段,将单克隆抗体与载体蛋白成功偶联,偶联物填柱形成IAC,并与AFT半抗原产生对应的特异性吸附关系。当样品通过柱子时,因抗原只能吸附相应的抗体,所以IAC也就只能吸附AFT,别的杂质因不被吸附而流出柱子。IAC的优点是在检测过程中,检测人员不用直接接触AFT,并接触很少试剂就完成整个检测。操作简单、耗时短、灵敏度高且能直接读数,所以应用范围很广。局限性是不能单独测AFB1、AFB2、AFG1和AFG2,只能测AFT总量,同时对试剂要求也较高,如检测过程中所有用到的水必须是双蒸水,而所用的容器也必须用双蒸水洗涤[19]。

2.4.2免疫亲和柱净化荧光光度法(SFB)

SFB是新发展起来的一种检测AFT的方法,其设备轻便、自动化高、操作简单、检测灵敏、时间短,广泛应用于检测日常饲料中的AFT是否超标。国外Vicam公司开发出的V2系列型荧光光度计,可以直接读取AFT的总量。但用SFB法检测中药材中AFT的含量时,结果中出现很多假阳性,造成结果不准确。王晶等用SFB法快速检测日常食用酱油和醋样品中AFT含量,其检出限分别是2·5μg/kg和1μg/kg,添加回收率在85%以上。

2.4.3酶联吸附法(ELISA)

ELISA是利用免疫、酶和生化技术来检测AFT。ELISA是上世纪70年代出现的新

的免疫技术[21],最初由荷兰学者an Weeman和瑞典学者Engvall与Perlman几乎同时提出,主要用于病毒的检测,70年代中后期开始用于真菌毒素的检测。ELISA以其简便、快速、灵敏、成本低、检测谱广等特点在检测方面越来越受到人们的青睐,是一种定性或半定量的方法。

ELISA的基本原理是首先将抗原或抗体固化。吸附在固相载体表面的抗原或抗体,仍然保持着其免疫学活性。其次是酶标记,被固定的抗原或抗体以共价键与酶连接形成酶结合物,而此物仍保持着免疫学和酶学活性。三是显色反应,酶标记物与相应的抗原或抗体反应,再加入底物显色液,来判定反应是否进行,颜色的深浅和免疫反应成比例的关系。所以通过显色可以判断反应是否进行,而通过后面的测定,又可以进行半定量检测。ELISA主要分为直接法测定抗原、间接法测定抗体[23,24]、双抗体夹心法测定抗原、竞争法测定抗原。

2.5 金标免疫层析检测技术(GICA)

GICA利用纳米金作为标记物,在很短的时间内就能测出待测物的含量,并可以直接读取结果。不需要分离纯化样品,也无需对检测溶剂做任何的处理,真正做到一步检测,方便、高效[25]。

Zhang等通过此方法分析一个样品,用时不到10min,非常高效[26]。在金标免疫试纸法的应用过程中,孙秀兰等研究了样品基质对试纸条信号灵敏度的影响,并为消除这些影响提供了经验。在检测样品中对粗提取液用氯仿法萃取后,使其挥干再溶解,可将盐离子和重金属离子对测定的影响控制在允许范围之内;用石油醚脱脂,可将油脂对测定结果的影响降到最低[27]。邓省亮等用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗AFB1单克隆抗体并喷于玻璃纤维上,AFB1偶联抗原和二抗分别结合于硝酸纤维膜上,依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维膜和吸水纸组装切割成胶体金试纸条并装入检测卡中。测试结果表明, AFB1快速检测试纸条的灵敏度为5ng/mL,检测时间为10min,批内和批间重复性100%,假阳性率和假阴性率均为0[28]。

黄曲霉毒素B1的检测方法

GB2761-2014《食品安全国家标准 食品中真菌霉素的限量》中对于黄曲霉毒素B1的限量以及检测方法做了修改，婴幼儿配方食品及婴幼儿辅助食品按照GB5009.24规定的方法测试，其他食品按照GB/T18979规定的方法测定。 TLC法是测定黄曲霉毒素的经典方法，是中国测定食品及饲料中AFT黄曲霉素B1(AFB1)的标准方法之一（GB/T5009.23-2006）。其原理是针对不同的样品，用适宜的提取溶剂将AFB1从样品中提取出来，经溶剂萃取纯化，再在薄层板上层析展开，分离，利用AFB1的荧光特性，根据荧光斑点的大小和强弱，比较测定黄曲霉毒素含量。

TLC有单项展开法和双向展开法，TLC法由于设备简单，易于普及，所以国内外仍在使用，但由于该法样品前处理繁琐，且提取和净化效果不够理想，提取液中杂质较多因而在展开时影响斑点的荧光强度，而双向展开虽避免了杂质干扰，增加了灵敏度，但增加了操作步骤和时间。 酶联免疫法检测AFB1的理论基础是抗原抗体反应，其采用单克隆或多克隆抗体技术，具有特异性强、分析时间短等优点。其原理是抗原（或抗体）吸附于载体上的免疫吸附剂和用酶标抗体（或抗原）与标本中的待测物（抗原或抗体）起特异的免疫学反应，最后用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度。大体分为2类：一是用双抗体夹心法检测样本中的AFTB1， 二是用竞争法检测样本中的AFTB1,。为了使用方便，目前国内外已研制了酶标记免疫吸附测定试剂盒及配套仪器,方法也被列入国家标准(GB/T5009.22 1996第二法)。

但由于ELISA法中酶的活性易受反应条件影响，因此ELISA法测定结果稳定性较差，分析结果的准确性不高，容易出现假阳性结果。 一般来说，组织中黄曲霉毒素含量很低，而液相色谱串联质谱法具有比高效色谱法更高的灵敏度和准确性，如今这种方法还极少使用在测定组织霉菌毒素含量中。该方法检测限可达0.02~0.025 ppb。 84%甲醇水溶液提取样品中,正己烷脱脂,HLB固相萃取柱净化。采用电喷雾电离,正离子扫描,选择多反应检测模式（MRM）监测,外标法定量，该法灵敏,结果可靠。

黄曲霉毒素的检验检疫

● 1995年，世界卫生组织制定的食品黄曲霉毒素最高允许浓度为15ug/kg.

● 中国政府对各种食物中黄曲霉毒素的最高允许量见表2.

表2 中国对食品中黄曲霉毒素的最高允许含量

食 物 名 称

最高允许含量/（ug/kg）

玉米花生，花生油,坚果和干果（核桃杏仁）

20（黄曲霉毒素B1）

玉米，花生仁制品（按原料折算）

20（黄曲霉毒素B1）

大米其他食用油（香油，菜籽油大豆油，葵花油胡麻油，茶油麻油，玉米胚芽油米糠油，棉籽油）

10（黄曲霉毒素B1）

其他粮食（麦类面粉，薯干），发酵食品（酱油食用醋，豆豉腐乳制品），淀粉类制品（糕点饼干，面包裱花蛋糕）

5(黄曲霉毒素B1）

牛乳及其制品（消毒牛奶，新鲜生牛乳全脂牛奶粉，淡炼乳，甜炼乳奶油，黄油）新鲜猪组织（肝，肾血，瘦肉）

0.5（黄曲霉毒素M1）

● 美国联邦政府有关法律规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量（指B1+B2+G1+G2的总量）不能超过15μg/kg.人类消费的牛奶中的含量不能超过0.5μg/kg，其他动物饲料中的含量不能300μg/kg。

● 而欧盟国家规定更加严格落花生和坚果及其加工产品和所有谷类食品及加工产品中黄曲霉毒素B1限量为2.0μg/kg；原奶、热处理奶及加工奶产品中M1限量为0.050μg/kg；婴儿食品（包括婴幼儿奶）中M1限量为0.025μg/kg。” 1、薄层层析法

薄层层析（Thin-Layer Chromatography,TLC）是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术.自1990年它被列为AOAC （Association of Official Agricultural Chemists）标准方法，该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能.

2、液相色谱法

液相色谱（Liquid Chromatography,LC）与薄层层析在许多方面具有相似性二者互相补充.通常用TLC进行前期的条件设定，选择适宜的分离条件后再用LC进行黄曲霉毒素的定量测定。

3、免疫化学分析方法

利用具有高度专一性的单克隆抗体或多克隆抗体设计的黄曲霉毒素的免疫分析方法也是最常用的黄曲霉毒素检测方法.这类方法通常包括放射免疫分析方法（Radioimmunoassay,RIA），酶联免疫法（Enzyme-linked of Immunosorbent Assay,ELISA）和免疫层析法（Immunoaflinity Column Assay,ICA）.它们均可以对黄曲霉毒素进行定量测定。

（1） 免疫亲和柱-荧光分光光度法和免疫亲和术-HPLC法

免疫亲和柱法和酶联免疫吸附法虽然都可达到速简便效果但酶联免疫吸附法仅能检测单一毒素（如黄曲霉毒素B1）含量，而且易出现假阳性结果难以控制.免疫亲和柱法（包括荧光光度法和HPLC法）却能达到既定量准确又快速简便的要求。

免疫亲和柱的使用可以避免传统TLC和HPLC的缺点，同时免疫亲和柱与TLC和HPLC法结合可以大大提高工作效率提高灵敏度和准确度。

黄曲霉毒素免疫亲和柱-荧光光度计法是以单克隆免疫亲和柱为分离手段，用荧光计紫外灯作为检测工具的快速分析方法。它克服了TLC和HPLC法在操作过程中使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物和在样品预处理过程中使用多种有毒，异味的有机溶剂毒害操作人员和污染环境的缺点.同时黄曲霉毒素免疫亲和柱-荧光光度计法分析速度快，一个样品只需10-15min，比传统方法快几个小时甚至几天时间；仪器设备轻便容易携带自动化程度高，操作简单直接读出测试结果，可以在小型实验或现场使用.可以进行黄曲霉毒素总量 （B1B2G1G2） 的测定检测限可达到1ug/kg，达到黄曲霉毒素标准限量值以下测定范围为1-300ug/kg。

黄曲霉毒素免疫亲和柱-高效液相色谱法比传统的HPLC法更加安全可靠，灵敏度和准确度高。它采用单克隆抗体免疫技术可以特效性地将黄曲霉毒素或其他真菌毒素分离出来，分离效率和回收率高。

分析原理试样中的黄曲霉毒素用一定比例的甲醇/水提取液经过过滤稀释后，用免疫亲和柱净化以甲醇将亲和柱上的黄曲霉毒素淋洗下来，在淋洗液中加入溴溶液衍生以提高测定灵敏度，然后用荧光分光光度计进行定量。也可以将甲醇-黄曲霉毒素淋洗液的一部分注入HPLC中对黄曲霉毒素B1,B2,G1,B2分别进行定量分析.免疫亲和柱是用大剂量的黄曲霉毒素单克隆抗体固化在水不溶性的载体上然后装柱而成.该方法的测定范围0-300ug/kg。

（2） 酶联免疫吸附法：

1996年，Nakane 建立了辣根过氧化物酶标记抗体的测定技术.由于该方法简便敏感，特异可作为多种抗原或抗体的测定，20世纪70年代后期该方法引入真菌毒素的检测中，下面介绍的是竞争性酶联免疫吸附间接法检测黄曲霉毒素B1。

原理：将已知抗原吸附在固态载体表面洗除末吸附抗原，加入一定量抗体与待测样品（含有抗原）提取液的混合液竞争培养后，在固相载体表面形成抗原抗体复合物.洗除多余抗体成分然后加入酶标记的抗球蛋白的第二抗体结合物，与吸附在固体表面的抗原抗体结合物相结合再加入酶底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应产生有色物质，通过酶标检测仪测出酶底物的降解量从而推知被测样品中的抗原量。

（3） 微柱筛选法

可以用来半定量测定各种食品中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2的总量。

原理 样品提取液中的黄曲霉毒素被微柱管风硅镁型吸附层吸附后在波长365nm紫外光灯下显示蓝紫色荧光环，其荧光强度与黄曲霉毒素在一定的光密度范围内成正比例关系.若硅镁型吸附剂层未出现蓝紫色荧光则样品为阴性（方法灵敏度为5-10ug/kg）.由于在微柱上不能分离黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2，所以测得结果为总的黄曲霉毒素含量。

（4） 一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法

一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法。由此产生的一步式黄曲霉毒素快速检测试纸可在5—10分钟完成对样品中黄曲霉毒素的定性测定.借助黄曲霉毒素标准样品这种方法能估算黄曲霉毒素的含量，非常适用于现场测试和进行大量样品的初选。

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